Entwicklung molekularbiologischer Nachweismethoden von Alicyclobacillus-Sporen nach einer Aptamer-basierten Anreicherung

FSMI 2013

Vortrag von Tim Hünniger, 18.02.2013

Hünniger, Tim; Jarck, Jan-Hinnerk; Herrmann, Luise; Haase, Ilka; Fischer, Markus
HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE - www.hsfs.org

Die Alicyclobazillen sind nach der Auskeimung der Sporen befähigt in verschiedenen Lebensmitteln, wie Apfel- oder Orangensäften, durch ihren Stoffwechsel, ein rauchig bzw. nach Desinfektionsmitteln riechendes off-Flavour (bspw. Guajacol) zu bilden. Derzeit stehen der Fruchtsaftindustrie allerdings nur bedingt analytische Methoden zur Verfügung, die während des Routinebetriebes einen zeitnahen Nachweis von Alicyclobacillus-Sporen ermöglichen, da stets ein zeitaufwendiger Anreicherungsschritt durch Kultivierung notwendig ist.
Ziel der Arbeit ist die Entwicklung eines Aptamer-basierten Bioaffinitäts-Anreicherungssystems über modifizierte Nanopartikel für die Lebensmittelmatrices Orangen- und Apfelsaft, wobei die anschließende qualitative und quantitative Bestimmung der Sporen mittels molekularbiologischer Methoden erfolgt. Die verwendeten Sporen-spezifischen Aptamere (einzelsträngige DNA, single stranded, „ss“) dienen dabei als Rezeptormoleküle und ersetzen die zeitaufwendige mikrobiologische Anreicherung der Alicyclobacillus-Sporen.
Die ssDNA-Aptamere werden nach einem speziellen in vitro Selektionsverfahren (SELEX-Prozess: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) hinsichtlich der Selektivität und Spezifität generiert. Anschließend erfolgen unterschiedliche molekularbiologische Methoden, wie bspw. die real time-PCR oder LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), für die Entwicklung einer qualitativen und quantitativen Bestimmungsmethode der Sporen.

Nach erfolgreicher Validierung eines Anreicherungssystems ist bei möglichen Kontaminationen von Lebensmitteln somit innerhalb kurzer Zeit eine sichere Analytik mit dieser molekularbiologischen Methode möglich.
Das Poster präsentiert Arbeiten zur Entwicklung des PCR-basierten Nachweissystems für die Sporen nach der Anreicherung. Dafür ist zunächst eine DNA-Isolation aus Alicyclobacillus - Sporen für einen sicheren Nachweis essentiell und setzt die Entwicklung einer geeigneten Methode zur Isolierung der DNA voraus. Die Sporenlyse ist gegenüber den vegetativen Zellen aufgrund der Sporenhülle ausschließlich durch eine mechanische Behandlung möglich. Die Verwendung von Ultraschall stellt dabei die schnellste und effektivste Methode hinsichtlich der Ausbeute und Handhabung für molekularbiologische Nachweise dar.

Als qualitativer Nachweis wurde eine klassische Endpunkts-PCR, die als real time-Methode für die vegetativen Zellen publiziert wurde, erfolgreich auf die Sporen adaptiert. Hierbei wird ein 134 bp großes Fragment aus der 16S rDNA amplifiziert und detektiert. Diese Methode konnte ebenfalls erfolgreich zu einer real time-PCR ausgebaut werden, welche die Möglichkeit der Sporenquantifizierung bietet.
Als weitere qualitative Nachweismethode wurde die isothermale Amplifikation (LAMP) entwickelt. Auch diese Methode basiert auf der Detektion eines Amplifikates der 16S rDNA. Die LAMP bietet aufgrund der hohen Produktbildung während der Amplifikation die Möglichkeit eine Detektion mit bloßem Auge vorzunehmen.

Das Poster finden Sie hier!