Food Science meets Authority 2014 Poster

  1. Entwicklung einer Analysenmethode zur spezifischen Bestimmung von 2- und 3-MCPD Ester in Fisch und Fischerzeugnissen

    S. Merkle, H. Karl, J. Fritsche, HAW Hamburg

    Details

  2. Entwicklung von salzreduziertem Weizenbrot und der Effekt der Zugabe von algenbasierten Zutaten auf dessen Eigenschaften

    S. Zaloga, D Wimmer, C. Pickardt, J. Fritsche, HAW Hamburg

    Details

    Abstract

    Gesundheitsbehörden weltweit empfehlen eine Reduzierung des Salzgehalts in verarbeiteten Lebensmitteln, um insbesondere das Risiko von Bluthochdruck zu senken (1). Jedoch erfüllt Salz in Lebensmitteln sensorische und technologische Funktionen, sodass eine Salzreduktion deren Eigenschaften nachteilig beeinflussen kann (2). Um durch Senkung des Salzgehalts auftretende Defizite zu kompensieren, wird an Salzalternativen geforscht. Am Fraunhofer-Institut wird im Rahmen des Forschungsprojektes TASTE ein Salzersatz aus essbarem Seetang entwickelt (3).

    Die vorliegende Studie wurde im Rahmen dieses Forschungsprojekts angefertigt. Ziel dieser Studie ist die Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher Inhaltsstoffe, abgeleitet von Algeninhaltsstoffen, auf die sensorische und technologische Qualität von salzreduziertem Weizenbrot. Die Ergebnisse werden für die Entwicklung von geschmacksaktiven Zutaten auf Algenbasis verwendet.

    Die Stoffe wurden in unterschiedlichen Konzentrationen in die salzreduzierte Standardrezeptur eingearbeitet. Im Rahmen der Studie wurden die Teigdehnbarkeit und der Dehnwiderstand, Höhe und Volumen, die Krumenfestigkeit und Farbe gemessen, um die Auswirkungen auf die technologischen Eigenschaften festzustellen. Weiterhin erfolgte eine Geschmacksprofilanalyse durch das Panel am Fraunhofer-Institut, um die Proben sensorisch zu analysieren. Exemplarisch wurden die Stoffe Kaliumchlorid, L-Lysin und Alginat untersucht.

    (1) WHO. (2013). A global brief on Hypertension. Abgerufen am 14. Januar 2014 von http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/79059/1/WHO_DCO_WHD_2013.2_eng.pdf

    (2) Dötsch, M., Busch, J., Batenburg, M., Liem, G., Tareilus, E., Mueller, R., Meijer, G. (2009). Strategies to Reduce Sodium Consumption: A Food Industry Perspective. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49(10), 841-851

    (3) Fraunhofer IVV. (2013b). TASTE. Essbarer Seetang – Salzreduktion in Lebensmitteln ohne Geschmacksverlust. Abgerufen am 14. Januar 2014 von http://www.ivv.fraunhofer.de/load.html?/mainframes/germany/business/gf_le_taste.html

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  3. Siedefettoptimierung zur Herstellung von transfettsäurearmen Siedegebäcken unter besonderer Berücksichtigung von technofunktionell-sensorischen Parametern

    K. D. Petersen, S. Merkle, N. Dietz, M. Schüring, K. Lösche, J. Fritsche, HAW Hamburg

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    Abstract

    Trans-Fettsäuren (trans fatty acids, TFA) erhöhen mit überzeugender Evidenz das Risiko zur Entwicklung von Herz-Kreislauferkrankungen [1,2]. Trotz intensiver Bemühungen der Lebensmittelbranche, die TFA-Gehalte in Lebensmitteln signifikant zu senken, liegen die TFA-Gehalte insbesondere in Siedegebäcken handwerklicher Herstellung oftmals sehr deutlich über den Aufnahmeempfehlungen der DGE [3,4]. Wesentliche TFA-Quellen sind unter anderem teilgehärtete Pflanzenöle, deren hohe thermische Stabilität verbunden mit guten sensorischen Eigenschaften (z.B. Schmelzverhalten im Mund) Gründe für die Verwendung als Siedefette bei der Herstellung von Siedegebäcken sind.
    Das Forschungsprojekt verfolgt das Ziel der technofunktionell-sensorischen Optimierung TFA-armer Fettblends für die Siedegebäckherstellung im Bäckereihandwerk. Dabei sollen zuerst kommerzielle TFA-arme Siedefette charakterisiert, verbraucherbezogene Akzeptanz- und Präferenzparameter sowie Optimierungspotentiale bezüglich der Siedefettblend-Zusammensetzung identifiziert werden. Im Anschluss sollen neue TFA-freie Siedefettblendkompositionen bestehend aus high-oleic Pflanzenölen und festen Fetten (solid fats) entwickelt werden. Diese lassen gegenüber den bisher genutzten Erdnuss- bzw. Palmölbasierten Fettblends sowohl ernährungsphysiologische als auch technofunktionell-sensorische Vorteile erwarten.
    Auf dem Poster sollen Daten aus dem Bereich der chemisch-analytischen und sensorischen Charakterisierung der TFA-armen Siedefettblends vorgestellt werden. Das Projekt wurde durch den Forschungskreis der Ernährungsindustrie (AiF Projektnr. AiF 17875 N) finanziell unterstützt.

    *HAW Hamburg – Ulmenliet 20 – 21033 Hamburg – Tel.: +49-(0)40-42875-6163 – Jan.Fritsche@haw-hamburg.de

    (1) WHO (2003). WHO Technical Series Report 916: Diet, Nutrition and the Prevention of chronic Disease. World Health Organization, Geneva.
    (2) EFSA (2010). Scientific Opinion of dietary reference values for fats, included saturated fatty acids, polyunsaturated fatty acids, monounsaturated fatty acids, trans fatty acids, and cholesterol. EFSA Journal 8: 1-107.
    (3) DGE (2002).Referenzwerte für die Nährstoffzufuhr. Deutsche Gesellschaft für Ernährung. Bonn.
    (4) Fritsche et al. (2012). Aktuelle Trans-Fettsäuregehalte in Siedegebäcken. J. Verbr. Lebensm. 7: 291-294.

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  4. Charakterisierung der Fruchtpulpa definierter Kakao-Genotypen (T. cacao L.) mittels HS-SPME-GC-MS/O und sensorischen Verfahren

    K. Ratprakhon, .K Schacht, K. D. Petersen, D. Kadow, J. Fritsche, HAW Hamburg

    Details

    Abstract

    Die fermentierten und getrockneten Samen des Kakaobaums (Theobroma cacao L.), häufig auch als Kakaobohnen bezeichnet, sind der Schlüsselrohstoff für die Schokoladenherstellung. Ursprünglich aus den Regenwaldgebieten an den Osthängen der Anden stammend wird der Kakaobaum heute in tropischen Regionen weltweit angebaut. Mehr als 70% der Weltgesamtproduktion werden in Westafrika erzeugt. Der Welthandel unterscheidet Kakaosamen, in Abhängigkeit vom Genotyp, in Konsum- und Edelkakao. Edelkakao macht nur knapp 5% des Weltweit produzierten Kakaos aus. Er unterscheidet sich vom Konsumkakao dadurch, dass er, neben dem charakteristischen Schokoladen-Flavour, spezielle fruchtige blumige und auch nussige Flavours entwickelt (Eskes et al., 2007, Kadow et al., 2013). Diese werden in ihrer Gesamtheit auch als Feinaromen bezeichnet. Edelkakao wird vielfach für dunkle Schokoladen eingesetzt und erzielt einen höheren Preis als Konsumkakao. Aus diesen Gründen gewinnt Edelkakao immer mehr an wirtschaftlicher Bedeutung.
    Sensorische Untersuchungen von Eskes et al., (2007) zeigten, dass die Komponenten des für Edelkakao charakteristischen Flavours offenbar aus der Fruchtpulpa stammen. Aufbauend auf diesen Befunden beschreiben Kadow et al., (2013) Monoterpene wie beispielsweise Linalool und Ocimen sowie Methylketone (z.B. Nonanon), sekundäre Alkohole (z.B. Heptanol) und deren Ester (z.B. Heptanolacetat) als für Fein-Flavour verantwortliche Komponenten (Kadow et al., 2013). Diese Substanzen könnten somit als Marker für die Charakterisierung von Edelkakao genutzt werden. Eine sensorische Bestätigung der Befunde von Kadow et al., (2013) steht jedoch noch aus.
    Ziel dieser Arbeit ist es deshalb, die flüchtigen Komponenten der Kakaopulpa, die für die Ausprägung des Fein-Flavours in den von Kadow et al., (2013) untersuchten Kakaogenotypen offenbar ausschlaggebend sind, über die qualitative und quantitative Bestimmung hinaus, sensorisch zu charakterisieren. Hierfür wurde zunächst eine Schnellmethode bestehend aus Headspace-Festphasemikroextraktion-Gaschromatographie-Massenspektrometrie und Olfaktometrie (HS-SPME-GC-MS/O) entwickelt. Die flüchtigen Komponenten werden dabei mittels GC/MS erfasst und die Intensität sowie Aroma-Aktivität der Einzel-Substanzen unter Einsatz des menschlichen Geruchsinns bestimmt (GCO-Technik). Die Panellisten wurden für die sensorischen Prüfungen nach DIN 10961 trainiert. Im nächsten Schritt soll nun, unter Einsatz dieser Methode, eine sensorische Profilprüfung des Geruchs und Geschmacks der frischen Kakaopulpa der von Kadow et al., (2013) untersuchten Kakaogenotypen erfolgen.

    Kadow, D. et al., (2013). Journal of Applied Botany and Food Quality 86, 90-98.
    Eskes, A.B. et al., (2007). INGENIC Newsletter 11, 22-28

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  5. Ei- Care - Optimierungskonzept von Eierverpackungen –  ein Beitrag zur Reduzierung der Lebensmittelverschwendung

    J. Lipski, U. Mack, J. Fritsche, B. Sadlowsky, HAW Hamburg

    Details

    Abstract

    Eier sind ein zerbrechliches Gut. Dies ist allgemein bekannt, weshalb die Kunden beim Kauf von Eiern den Verpackungsinhalt fast immer prüfen. Konkrete Statistiken, die Art und Ursache der Schäden an Eiern erfassen, gibt es nicht. In einem Scientific Project im Rahmen des Studienganges Food Science an der Hochschule für angewandte Wissenschaften in Hamburg, in Zusammenarbeit mit dem BFSV Verpackungsinstitut Hamburg, befasste man sich mit den Schutzeigenschaften der Eierverpackung.
    Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass bei einer Durchsicht von neu angelieferter Ware in einem Selbstbedienungswarenhaus ein Bruchanteil von 1,4 % entstehen kann. Dieser Schaden wird zum einen durch Transport-, Lager- und Umschlagbelastungen verursacht, als auch durch das Handling des Kunden am POS. Damit entstehen sehr hohe Verluste, die in Hochrechnungen, auf den deutschlandweiten Eierverkauf von jährlich 17.338 Millionen1 und der Annahme eines Preises von 10 Cent2 pro Ei bezogen, 19.765.320,00 € betragen.
    Bei Vor- Ort- Begehungen in den Packstellen konnten als mögliche Ursachen zum Teil fehlende Modularität der Eierverpackungen und deren Transportverpackungen dokumentiert werden. Hierdurch entstehen Überstände auf den Paletten, die beim innerbetrieblichen Umschlagprozess zu Schäden an dem Packgut führen können.
    Dass die fehlende Modularität einer der Hauptgründe für die Schäden ist, wird durch die Art und Lage der Schäden in den Eierverpackungen untermauert. Besondere Risikozonen bilden die Flanken der Eierverpackung, wo die Eier von der Verpackung am geringsten geschützt werden. Hierdurch entsteht ein hohes Schadensrisiko, wenn eine Transportverpackung aus Wellpappe über die Palette hinausragt und sich verbiegt.
    Des Weiteren wurde festgestellt, dass die Transportverpackungen aus Wellpappe plastische Verformungen aufweisen, die durch eine Überstapelung, als auch durch eine zu geringe Wellpappenqualität entstehen können.
    Der Formschluss der Eier innerhalb der Eierverpackung, als auch der Eierverpackung in der Transportverpackung, bestimmt maßgeblich wie viele Eier Schaden durch den Transport nehmen. In diesen Bereichen ist die klassische Eierverpackung optimierbar. Dazu können die Seiten der Verpackung stabiler gestaltet werden. Des Weiteren sollte die Modularität der Eierverpackungen und Transportverpackungen aufeinander angepasst werden, sodass sie formschlüssig auf Europaletten befördert werden können.

    Kontakt: Bernd.sadlowsky@bfsv.de

    1 BMELV (2013): Kennzahlen des deutschen Eiermarktes. BMELV. Aufgerufen am 25.06.13 von http://www.bmelv.de/SharedDocs/Downloads/Landwirtschaft/Tier/TierzuchtTierhaltung/KennzahlenEiermarkt-Maerz2013.pdf?__blob=publicationFile
    2 Eiervertriebsgesellschaft mbH & Co.KG (2013): Marktbericht KW 10/2013, DEU. Eiervertriebsgesellschaft GmbH & Co. KG. Aufgerufen am 06.03.2013 von http://www.deu-eier.de/cms/front_content.php?idcat=76

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  6. Melatoningehalt in Nachtmilchpulver

    K. Riehn, M. Köthe, J. Kratzsch, S. Hickmann, K. Hillmer, P. G. Braun, HAW Hamburg

    Details

    Abstract

    Melatonin ist ein körpereigenes Hormon, welches in der Epiphyse produziert wird und eine entscheidende Rolle in der Regulation des Tag-Nacht-Rhythmus spielt. In der Humanmedizin wird Melatonin als verschreibungspflichtiges Arzneimittel zur kurzzeitigen Therapie bei Schlafstörungen im Alter (> 50 Jahre) eingesetzt. Allerdings sind auch freiverkäufliche Präparate auf dem Markt, welche laut Anbieter bei Schlafstörungen, als Anti-Aging Mittel oder zur Stärkung des Immunsystems eingenommen werden sollen. Eines dieser Produkte ist die sogenannte Nachtmilch, eine unter speziellen Licht- und Fütterungsregimen gewonnene Kuhmilch, welche einen fünf- bis achtmal höheren Gehalt an Melatonin im Vergleich zu herkömmlicher Milch haben soll. Angeboten wird diese Milch als Lebensmittel im Handel, z. B. in gefriergetrockneter kristallisierter Form, die laut Kennzeichnung einen Melatoningehalt von 1.800 pg pro 12 g Portion aufweisen soll.
    Ziel unserer Untersuchung war die Bestimmung des Melatoningehaltes in Nachtmilchpulver im Vergleich zu herkömmlicher Kuhmilch. Dafür wurde der Melatoningehalt von 23 verschiedenen Sorten (H-Milch-, Frischmilch- und Rohmilchproben) sowie von in Aqua dest. bzw. H-Milch gelöstem Nachtmilchpulver ermittelt. Zu diesem Zweck wurden alle Proben im Verhältnis 1:5 verdünnt und der Melatoningehalt mittels „Melatonin ELISA Saliva“ Testkits (IBL International GmbH Hamburg) im Doppelansatz bestimmt.
    Die ermittelten Melatoningehalte reichten von 2,86 pg/ml bis 25,49 pg/ml. Dabei wies H-Milch den niedrigsten Wert mit durchschnittlich 6,76 pg/ml auf. Die Gehalte an Melatonin in Frischmilch und in demn gelösten Nachtmilchpulver unterschieden sich mit durchschnittlich 13,71 pg/ml bzw. 15,18 pg/ml nur unwesentlich voneinander. Auch die Rohmilch wies einen hohen durchschnittlichen Melatoningehalt von 17,03 pg/ml auf, wobei die Werte bei den einzelnen Proben recht stark streuten. Die statistische Auswertung mittels Kruskal-Wallis-Test mit angeschlossenem Dunn’s-Test zeigte, dass die Nachtmilch gegenüber keiner anderen Gruppe einen signifikant unterschiedlichen Melatoningehalt aufwies. Statistisch signifikant war nur der Unterschied zwischen H-Milch und Rohmilch (p < 0,05).
    Obwohl unsere Untersuchung mit einer geringen Probenanzahl (n = 24) durchgeführt wurde, zeigt sich bereits, dass eine Portion des untersuchten Produktes mit ca. 3000 pg nur unwesentlich mehr Melatonin enthält als ein 200-ml-Glas Frischmilch mit ca. 2750 pg.

  7. Untersuchung zur Anwendung der Mikrowellenextraktion und ihrem Einfluss auf die Wiederfindung von PCDD/F und PCB

    J. Neßler, F. Focke, M. Opel, J. Fritsche, HAW Hamburg

    Details

    Abstract

    Polychlorierte-p-dioxine und Dibenzofurane sowie polychlorierte Biphenyle sind bekannt als Umweltkontaminanten. Aufgrund ihrer Vielfältigkeit und hohen Beständigkeit zeigen sie Carry-over-Effekte und sind deshalb seit langem auch in tierischen Lebensmitteln nachzuweisen (Ballschmiter & Bacher, 1996). PCDD/Fs und PCBs reichern sich aufgrund ihrer Stoffeigenschaften in fetthaltigem Gewebe an. Aus diesem Grund bedarf es zu Beginn der eigentlichen Bestimmung einer Fettextraktion. Als Extraktionsmethoden dienen hierfür überwiegend die Soxhlet- und die beschleunigte Lösemittelextraktion (ASE). Nachteilig werden jedoch lange Extraktionszeiten, große Lösungsmittelmengen oder aber Anfälligkeit und Reparaturaufwand der ASE Apparatur angesehen. Dem soll mit Hilfe der mikrowellenunterstützten Extraktion entgegengewirkt werden. Dabei spielen die Einfachheit sowie Zeit- und Kosteneffizienz eine wichtige Rolle.
    Ausgehend von der Lebensmittelmatrix Ei wird eine Optimierung der Extraktionsbedingungen durchgeführt und wie folgt verfahren:
    1. Optimierung der Extraktionsmethode mit dem Mikrowellensystem Discover SP-D und Explorer SP-D der Firma CEM. Anschließender Vergleich mit den gängigen Methoden zur Fettextraktion. Bewertung der Extraktionseffizienz unter Betrachtung der Parameter Zeit, Temperatur und Lösungsmittel sowie der Trennung des Extraktionsguts vom Extraktionsrückstand.
    2. Messung der Dioxine, Furane und PCBs mittels GC/HRMS und anschließender Vergleich der Wiederfindungen mit den gebräuchlichen Extraktionsmethoden.
    Die Ergebnisse der mikrowellenunterstützten Fettextraktion sind vergleichbar mit den Ergebnissen der Soxhletextraktion und ASE. Eine Extraktionseffizienz von über 90 % (bezogen auf den theoretischen Fettgehalt von Ei) konnte erzielt werden. Hierbei spielte die Entfernung des Extraktionsrückstands vom Extraktionsgut eine wichtigere Rolle als z.B. die Extraktionszeit. Dieses Phänomen spiegelt sich auch bei der Messung der Dioxine, Furane und PCBs wider. Die Wiederfindungsraten sind überwiegend im akzeptablen Bereich und variieren je nach Trennungsverfahren.
    Bei erfolgreicher Etablierung der Methode wird diese für die untersuchte Matrix Ei validiert, um anschließend als Routineverfahren eingesetzt werden zu können. Des Weiteren kann der Extraktionsprozess für weiterer Matrizes, wie z.B. Fisch/Fischmehl, oder aber auch für Fleisch/Fleischprodukte mit Hilfe des Mikrowellensystems zeit- und kosteneffizient optimiert werden.

    Ballschmiter, K., & Bacher, R. (1996). Dioxine-Chemie, Analytik, Vorkommen, Umweltverhalten und Toxikologie der halogenierten Dibenzo-p-dioxine und Dibenzofurane (1st ed.). Weinheim: VHC.

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  8. Quantitative Bestimmung des Fettsäureprofils von neutralen Lipiden, Phospholipiden und freien Fettsäuren in biologischen Proben

    A. Ostermann, M. Müller, N.H. Schebb, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

    Details

    Abstract

    Viele Studien kommen zu dem Schluss, dass langkettige n3-Fettsäuren (LC n3-PUFA) wie Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) unter anderem das Risiko für kardiovaskuläre Krankheiten senken und anti-inflammatorisch wirken. Um die zu Grunde liegenden Mechanismen oder die Nutriokinetik dieser Lebensmittelinhaltstoffe verstehen zu können, ist eine schnelle und effiziente Methode zur Bestimmung von Fettsäuren Voraussetzung. Von besonderem Interesse sind hier die Verteilung der LC n3-PUFA im Organismus sowie die Inkorporation in verschiede Lipidklassen, bspw. Phospholipide oder Triglyceride. Das Ziel dieser Studie war daher die Entwicklung einer Methode zur differenzierten Analyse von Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrer Bindungsform. Dafür wurde eine Probenaufarbeitungstrategie mit anschließender Analyse der Fettsäuren mittels Gaschromatographie gekoppelt mit Flammenionisationsdetektion (GC-FID) optimiert.

    Unter Verwendung von Methyl-tert-butylether und Methanol (2:1) als Extraktionsmittel konnten die Analyte in einem einzigen Extraktionsschritt aus Plasma isoliert werden [1]. Die Effektivität der Methode und das Probenhandling wurden mit dem Standardprotokoll von Bligh und Dyer [2] verglichen. Dabei wurden mit dem vorgestellten Protokoll für einige Analyte, wie beispielsweise DHA oder Arachidonsäure signifikant höhere Konzentrationen erhalten. Weiterhin sprechen das verbesserte Probenhandling sowie die Verwendung halogenfreier Lösungsmittel für die verwendete Methode.

    Mittels Festphasenextraktion an einer mit Aminopropylgruppen modifizierten Kieselgelsäule konnte der Lipidextrakt in drei Fraktionen getrennt werden [3]. Die erste Fraktion wurde mit Chloroform/Isopropanol (2:1) eluiert und enthielt neutrale Lipide, wie Cholesterolester und Triglyceride. Die polareren freien Fettsäuren wurden anschließend mit Diethyether/Essigsäure (98:2) von der Säule eluiert. In der letzten Fraktion eluierten mit Methanol die polaren Phospholipide. Vor der Analye wurden die Lipide mit Trimethylsulfoniumhyroxid in ihre entsprechenden Methylester überführt.

    Die Quantifizierung erfolgte mittels GC-FID. Hier wurde eine Kapillarsäule mit quervernetztem Polyethylenglykol als stationäre Phase benutzt, die eine Separation von 36 Fettsäuren innerhalb von 22 Minuten erlaubte. Der lineare Bereich lag zwischen 0,54 und 18000 µg/mL.
    Die vorgestellte Methode wurde erfolgreich an Human- und Rattenplasma angewendet. Nur 100 µL Plasma waren nötig um die Fettsäureprofile der einzelnen Lipidfraktionen zu charakterisieren. Zusammenfassend ist es uns gelungen eine Methode zu etablieren,  mit der die Effekte einer Supplementation mit LC n3-PUFA in Blut- und Gewebeproben umfassend untersucht werden können.

    [1] Matyash V, Liebisch G, Kurzchalia TV, Shevchenko A, Schwudke D (2008) J Lipid Res, 49, (5), 1137-46.
    [2] Bligh EG, Dyer WJ (1959) Can J Biochem Physiol, 37, (8), 911-7.
    [3] Kaluzny MA, Duncan LA, Merritt MV, Epps DE (1985) J Lipid Res, 26, (1), 135-40.

  9. Modulation des Oxylipinmusters im Blut durch Fischölsupplementation

    N.H. Schebb, J.P. Schuchardt, I. Willenberg, S. Schmidt, A. Hahn, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

    Details

    Abstract

    Eine Vielzahl von Studien belegen die gesundheitsförderliche Wirkung von langkettigen mehrfach ungesättigten n3-Fettsäuren (LC-n3-PUFA). Insbesondere zeigt eine erhöhte
    Zufuhr der in Fischöl enthaltenen LC-n3-PUFAs Eicosapentaensäure (EPA, C20:5) und Docosahexaensäure (DHA, C22:6) eine blutdrucksenkende, antiarrhythmische und
    antiinflammatorische Wirkung sowie positive Effekte auf den Lipidmetabolismus. Darüber hinaus werden EPA und DHA aufgrund ihrer Triglycerid senkenden Eigenschaften vielfach
    zur Behandlung von Hypertriglyceridämie eingesetzt.

    Die molekularen Mechanismen der Wirkungen von LC-n3-PUFA sind bisher nur schlecht verstanden. Man geht davon aus, dass ein Teil der Effekte von EPA und DHA über ihre
    oxidativen Metabolite – Oxylipine – vermittelt wird, die als potente Lipidmediatoren diverse Stoffwechselprozesse beeinflussen. Neben der durch Cyclooxygenasen gebildeten
    Prostaglandine und durch Lipoxygenasen gebildeten Leukotriene zeigen neuere Studien hier die Bedeutung von Hydroxy-, Epoxy- und Dihydroxy-Fettsäuren auf. Allerdings ist nur wenig
    über die endogenen Spiegel dieser Mediatoren im Menschen sowie deren Beeinflussung durch die Ernährung bekannt.

    In vorrangegangenen Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Blutkonzentration von Hydroxy-, Epoxy- und Dihydroxy-Fettsäuren stark von dem endogenen Status der Präkursor-LC-n3-
    PUFAs abhängig ist, was auf eine gute Beeinflussbarkeit durch die Ernährung, z.B. durch einen erhöhten Fischverzehr, schließen lässt. Hingegen scheinen Störungen des
    Lipidstoffwechsels keinen Einfluss auf die Oxylipinspiegel zu haben. Zwischen Gesunden und Hyperlipidämikern fanden wir keine biologisch signifikanten Unterschiede in den
    Oxylipinspiegeln und -mustern (Schuchardt et al.).

    In der vorliegenden Studie untersuchten wir den Effekt einer 12 wöchigen Supplementation mit Fischöl auf das Oxylipinmuster in einer Gruppe von 20 Männern. Die Serumkonzentration
    eines umfassenden Sets an 45 Hydroxy-, Epoxy- und Dihydroxy-Fettsäuren wurden simultan mittels LC-MS (targeted Metabolomics) bestimmt. Nach Supplementation zeigten sich die stärksten Effekte in den Blutspiegeln der EPAOxylipine (Anstieg um 150-1400%), wobei vor allem die Gehalte der Epoxy-Fettsäuren stark anstiegen. Hingegen war der Anstieg der aus DHA gebildeten Metaboliten mit 30-130% moderat. Unterschiedlich war die Wirkung auf die Oxylipine anderer LC-PUFAs. So reduzierte die Fischölsupplementation die Konzentration an Epoxy- und Dihydroxy- Arachidonsäure während die Konzentration an Hydroxy- Arachidonsäure anstieg. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Fischölsupplementierung direkt die Blutspiegel und Muster der Hydroxy-, Epoxy- und Dihydroxy-Fettsäuren beeinflusst. Insbesondere der Einfluss auf verschiedene Epoxy-EPAs, die als potent vasodilatorische und antiarrhythmische Mediatoren gelten, kann zur Erklärung der gesundheitsförderlichen Wirkungen von Fischöl beitragen.

    Schuchardt, J. P.; Schmidt, S.; Kressel, G.; Dong, H.; Willenberg, I.; Hammock, B. D.; Hahn, A.; Schebb, N. H., Comparison of free serum oxylipin concentrations in hyper- vs. normolipidemic men. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids 2013, 89, (1), 19-29.

  10. Limitierende Faktoren der enzymatischen Weizenglutenhydrolyse

    L. Giesler, D. Linke, R.G. Berger, Leibniz Universität Hannover

    Details

    Abstract

    Proteinhydrolysate dienen in Lebensmitteln wie Suppen, Soßen, Süßwaren oder Kosmetika zur Verbesserung der funktionellen Eigenschaften oder als Geschmacksverstärker [1, 2]. Zur Herstellung von Speisewürze wird vor allem Weizengluten genutzt, welches als Nebenprodukt bei der Gewinnung von Stärke anfällt. Die Steuerung der enzymatischen Proteinhydrolyse (Peptidolyse) stellt einen kritischen Prozessparameter in der konstanten Produktion und dem Erhalt der gewünschten funktionellen und geschmacklichen Eigenschaften dar. Bislang konnten trotz Verwendung verschiedener Mischungen aus Endo- und Exopeptidasen nur Hydrolyseausbeuten unter 40 % erzielt werden. Mögliche limitierende Faktoren sind die Autopeptidolyse der Enzyme, ein Mangel an Spaltstellen im Substrat und Produktinhibierung.  
    Untersuchungen mit einer neuartigen Peptidasemischung aus dem Basidomyceten Flammulina velutipes und dem kommerziell eingesetzten Enzympräparat Flavourzyme (Novozyme) zeigten, dass mit steigender Substratkonzentration die autopeptidolytische Aktivität der Peptidasen unterdrückt werden kann. Weiterhin wurde für die in Flavourzyme enthaltenen Peptidasen eine Kombination aus Produktinhibierung und einem Mangel an Spaltstellen im Gluten beobachtet. Hingegen zeigten Flammulina velutipes Peptidasen keine Limitierung für die Hydrolyse von Gluten. Die bereits für beide Präparate beschriebene Produktinhibierung [3] konnte mittels einer siebenfach in den Hydrolyseprozess (100 g/L Gluten und 10 kaU/mL) integrierten Elektrodialyse und der damit verbundenen in situ Abtrennung der Aminosäuren minimiert werden. Es zeigte sich ein nahezu linearer Prozessverlauf über 16 Stunden und ein dreifach gesteigerter Hydrolysegrad im Vergleich zum Batchprozess. Die Überwindung der Produktinhibierung mittels Elektrodialyse bietet damit eine effiziente Möglichkeit der optimierten Herstellung von Speisewürze.

    1.    Zhang, H.-H., et al., Effect of cysteine on structural, rheological properties and solubility of wheat gluten by enzymatic hydrolysis. International Journal of Food Science & Technology, 2010. 45(10): p. 2155-2161.
    2.    Kong, X., H. Zhou, and H. Qian, Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates. Food Chemistry, 2007. 102(3): p. 759-763.
    3.    Giesler, L., et al., Hydrolysis of wheat gluten by combining peptidases of Flammulina velutipes and electrodialysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013.

  11. Heterologe Expression der Lipoxygenase 1 aus Pleurotus sapidus

    S. Kelle, R.H. Leonhardt,R.G. Berger, Leibniz Universität Hannover

    Details

    Abstract

    Lipoxygenasen (LOX) sind eine Familie von Nicht-Häm-eisenhaltigen Enzymen, welche die regio- und stereospezifische Dioxygenierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) katalysieren. In der Lebensmittelchemie ist vor allem die von LOX katalysierte radikalisch enzymatische Spaltung von Fettsäurehydroperoxiden zu Aromastoffen von Interesse. Hierbei entstehen je nach Ausgangsstoff vor allem C6- und C9- Aldehyde und Alkohole, die beispielsweise für Fruchtaromen ((E)-2-Hexenal und (Z)-3-Hexenal) oder Gurkenaroma (2-Nonenal und (E,Z)-2,6-Nonadienal)  charakteristisch sind. Industriell kommen Lipoxygenasen vor allem im Bereich der Backwarenproduktion zum Einsatz. Unter Nutzung der von Soja-LOX katalysierten radikalbasierten Bleichungs- und Quervernetzungsreaktionen kann neben einer Entfärbung auch die Rheologie von Weizenmehlteig verbessert werden.
    Die bereits charakterisierte Lipoxygenase 1 (Lox1) aus Pleurotus sapidus wurde bereits erfolgreich für die Transformation von (+)-Valencen über intermediäre Hydroperoxide zu dem wertvollen Grapefruit Aromastoff (+)-Nootkaton eingesetzt. Da die Verfügbarkeit von nativem Enzym aus Pleurotus sapidus gering ist, wurde die heterologe Expression der Lox1 angestrebt. Hierbei wurde das LOX1 Gen sowohl im prokaryotischen Expressionswirt E. coli als auch in der eukaryotischen Hefe Pichia pastoris exprimiert [1, 2]. In Klonen von beiden Expressionsstämmen wurde aktives und lösliches Enzym produziert. Die Reinigung erfolgte über einen N-terminalen Hexa-Histidin-tag, um die biochemische Charakterisierung durchzuführen. Sowohl das pH- und Temperaturoptimum als auch die vmax des Wildtyp-Enzyms waren mit den beiden rekombinant produzierten Enzymen vergleichbar [3].
    Auf der Suche nach weiteren viel versprechenden Enzymen wurde mit Hilfe der bereits bekannten Gensequenz Primer für das LOX1-Gen abgeleitet, um eine Gruppe nahe verwandter Organismen (P. ostreatus, P. sapidus, P. sajor-caju, P. dryinus) nach orthologen Genen zu suchen. Dabei gelang es, vier neue Lipoxygenase-Gene zu amplifizieren, zu klonieren und heterolog zu exprimieren.

    [1]    R.-H. Leonhardt, I. Plagemann, D. Linke, K. Zelena, R.G. Berger, Orthologous lipoxygenases of Pleurotus spp. - A comparison of substrate specificity and sequence homology. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 97 (2013) 189-195.
    [2]    S. Kelle, K. Zelena, U. Krings, D. Linke, R.G. Berger, Expression of soluble recombinant lipoxygenase from Pleurotus sapidus in Pichia pastoris. Protein Expression and Purification [Paper accepted] (2014).
    [3]    I. Plagemann, U. Krings, R.G. Berger, Isolation and characterization of wild-type LOXPsa1 from Pleurotus sapidus. Zeitschrift für Naturforschung C, A Journal of Biosciences (Manuscript submitted).

  12. Untersuchung zur thermischen Stabilität von DDMP-Saponin in Erbsen mittels HPTLC

    V. Reim, S. Rohn, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    Aus ernährungsphysiologischer Sicht sind Erbsen (Pisum sativum L.) ausgezeichnete Nährstofflieferanten. Neben hochwertigem Eiweiß, Kohlenhydraten und wenig Fett verfügen sie zudem über zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe, wie u.a. auch Saponine.
    Saponine (lat. sapo = Seife) sind vorwiegend in nährstoffreichen pflanzlichen Geweben vorkommende Glykoside. Benannt nach dem Ursprung ihrer Entdeckung, der Sojabohne (Glycine max), werden die in Erbsen enthaltenen Saponine als Sojasaponine bezeichnet. Hierbei handelt sich um triterpenoide Glykoside, basierend auf einem apolaren Aglykon (Sapogenin), an dem ein oder mehrere Zuckerketten diverser Monosaccharide verknüpft sind. Je nach Anzahl der Saccharidketten unterscheidet man zwischen mono-, bi- oder tridesmosidischen Saponinen.
    Erbsen weisen zwei Saponinformen auf: das DDMP-Saponin (Sojasaponin βg) und das Saponin B (Sojasaponin I). Aufgrund der an C3-Position des Aglykons befindlichen Zuckerkette handelt es sich um monodesmosidische Verbindungen. Im Vergleich zum Saponin B enthält das DDMP-Saponin einen 2,3-Dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4Hpyran-4-on (DDMP)-Rest an Position C22. Das DDMP-Saponin ist nur bedingt stabil und hydrolysiert unter bestimmten Bedingungen während der Lebensmittelbe- und -verarbeitung zum Saponin B und Maltol. Stabilitätsrelevante Faktoren sind u.a. Extraktionsmittel, pH-Wert oder die Temperatur.
    Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich die gewählten Extraktionsparameter auf die thermische Stabilität der DDMP-konjugierten Saponinform auswirken. Hierfür wurden aus ungeschälten Trockenerbsen gewonnene Saponinextrakte Temperaturen von 50 °C und 60 °C über einen Zeitraum von 1-24 h ausgesetzt. Die Analyse erfolgte mithilfe der HPTLC (high-performance thin-layer chromatography) und postchromatographischer Derivatisierung mit p-Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz.
    Unbehandelte Proben enthielten durchschnittlich 20-30 % mehr an DDMP-Saponin als Saponin B. Tendenziell verhielt sich die Instabilität des DDMP-Saponins bei beiden Temperaturen ähnlich. Innerhalb von 4 h wurde ein 10-30 %-iger Anstieg von Saponin B und ein indirekt proportionaler Abfall des DDMP-Konjugats festgestellt. Nach 24 h-Erhitzen war das DDMP-Saponin nahezu vollständig zum Saponin B transformiert. Der Gesamtsaponingehalt blieb hingegen während der Hitzeeinwirkung unbeeinflusst. Etwaige Reaktions- oder Abbauprodukte in Form von zusätzlichen Substanzzonen wurden nicht detektiert.

  13. Massenspektrometrische Charakterisierung von Enzym-Lactose-Derivaten

    J. Biller, M. Klukkert, L. Morschheuser,  C.S. Leopold, M. Trusch, S. Rohn, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    Enzymatische Arzneistoffe werden im Rahmen der Pharmakotherapie zur Substitution körpereigener Proteine eingesetzt. So wird ein Mangel körpereigener Verdauungsenzyme bei Pankreasinsuffizienz durch Verabreichung pankreatischer Enzyme (wie z.B. alpha-Amylase und Lipase) therapiert [1, 2].

    Interaktionen zwischen enzymatischen Arzneistoffen und pharmazeutischen Hilfsstoffen wie z.B. Lactose, einem häufig eingesetzten Füllstoff in der Tablettierung, können zur Modifizierung des Proteins des Arzneistoffs und somit zu sinkender biologischer Aktivität sowie immunologischen Reaktionen führen. Die Charakterisierung und Identifizierung der dabei entstehenden Produkte bilden die Grundlage zum Verständnis des resultierenden Einflusses auf die Eigenschaften des Präparats bzw. seiner Risiko-Nutzen-Bewertung.
    In der vorliegenden Studie wurden tablettierte Präparate auf der Basis von alpha-Amylase und Lactose charakterisiert. Die Tablettierung erfolgte auf einer Rundläuferpresse (Labor-Tablettenpresse 102i, FETTE Compacting GmbH, Schwarzenbek) bei einem Pressdruck von 40 und 400 MPa. Nachfolgend wurden Lagerungsversuche unter Variation der Lagerungstemperatur und Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Die anschließende Untersuchung der Präparate erfolgte nach proteolytischem Abbau mit Trypsin und der Messung der erhaltenen Peptide mittels MALDI-TOF(/TOF)-MS (ultrafleXtreme, Bruker Daltonik GmbH, Bremen) [3]. Zuvor erfolgte eine chromatographische Trennung der erhaltenen Peptide mittels HPTLC (High performance thin layer chromatography) unter Verwendung von Cellulose als stationäre Phase und eines Laufmittelgemischs aus 2-Butanol, Pyridin, Ammoniak und Wasser [4]. Darüber hinaus wurden die Peptide nach der Trennung für ergänzende Informationen mittels UV-Detektion sowie verschiedener Derivatisierungsreagenzien (Fluorescamin-, Ninhydrin- oder Diphenylamin-p-Anisidin-Reagenz) angefärbt und visualisiert (TLC Visualizer, CAMAG Chemie-Erzeugnisse & Adsorptionstechnik AG & Co. GmbH, Berlin). Durch die vorangehende dünnschichtchromatographische Trennung sollte eine spezifische Detektion und Zuordnung möglicher Modifikationen erreicht werden. Die simultane Analyse mehrerer Proben bietet dabei die Möglichkeit des direkten Vergleichs zwischen modifizierter und nicht-modifizierter alpha-Amylase. Ebenso konnte eine direkte Gegenüberstellung der Einflussfaktoren bei der Tablettierung und Lagerung erfolgen.
    Ferner wurden durch verschiedene Derivatisierungen zusätzliche Informationen über
    die entstandenen Produkte erhalten, die mittels direkter HPTLC-MALDI-MSKopplung
    genauer charakterisiert werden konnten.

    [1] Miller W., DMW (1946) 2008, 133, 9, 323-326
    [2] Desser, L.; Zavadova, E.; Herbacek, I., Int J Immunother 2001, 17, 2/3/4, 153-161
    [3] Bruker Daltonik GmbH, Analysis of N-glycosylated Peptides, 2008
    [4] Pasilis et al., Anal. Bioanal. Chem., 2008, 391, 317-324;

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  14. Proteinanalytik im Detail – Anwendungsmöglichkeiten der nanoESI-MS zur Identifizierung von Proteinen und dem Nachweis von Proteinmodifikationen

    L. Morschheuser; J. Biller; M. Trusch; S. Rohn, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    Während die traditionelle Proteomanalytik etwa zehn Jahre lang versucht hat, die Gesamtheit der Proteine zu kartographieren, geht der Trend inzwischen wieder in Richtung der detaillierten Analytik einzelner Proteine.
    Speziell die Identifikation von posttranslational modifizierten Proteinen (PTM) rückt dabei in den Vordergrund. Zur Charakterisierung der diversen Modifikationen stehen der Forschung jedoch nur wenige Methoden zur Verfügung, der Bedarf an neuen, innovativen Ansätzen ist hoch. Ein mögliches Werkzeug zur Identifizierung von gereinigten Proteinen und möglichen Modifikationen stellt dabei ein off-line nanoESI-MS-System (bspw. TriVersa Nanomate® Advion, USA) dar. Die davon ausgehenden Analysemöglichkeiten werden anhand des Beispielproteins Myoglobin gezeigt. Speziell die Analytik des intakten Proteins mittels ETD/PTR-Messung profitiert von der langen Messzeit des off-line nanoESI-MS-Systems.
    Darüber hinaus bietet die Kopplung des MS an eine Nanomate-Quelle die Option, mittels Liquid Extraction Surface Analysis (LESA) Analyten direkt von einer hochauflösenden Dünnschichtchromatographie-Platte (HPTLC) zu messen. So kann das Protein nach enzymatischem Verdau zunächst mittels HPTLC getrennt und die Peptide im Anschluss durch ein gekoppeltes HPTLC-nanoESI-MS analysiert werden. Dies bietet Vorteile gegenüber traditionellen LC-MS-Ansätzen, da gezielt Peptide angesteuert werden können, die eine Modifikation vermuten lassen. Die Vortrennung von Peptiden per HPTLC stellt durch ihre hohe Auflösung und die Möglichkeit zur MS-Kopplung eine sehr gute Alternative zur LC-MS bezüglich der Trennung modifizierter bzw. unmodifizierter Peptide dar.

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  15. Untersuchung der Bioaktivität von natürlich vorkommenden Nitrilen im humanen in-vitro Modell

    F. Kupke, S. Platz, C. Herz, F.S. Hanschen, M. Schreiner, S. Rohn, E. Lamy, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract 

    Glucosinolate sind sekundäre Pflanzenstoffe, die in Brassicaceae (z. B. Brokkoli, Kapuzinerkresse und Meerrettich) als Fraßschutz gebildet werden. Bei Zellverletzung werden die Glucosinolate durch das Enzym Myrosinase, unter Abspaltung von Glucose und Sulfat, zu Isothiocyanaten oder Nitrilen hydrolysiert. Die Bioaktivität von Isothiocyanaten wurde bereits intensiv untersucht. Sie steigern beispielsweise in normalen Zellen die Aktivität von detoxifizierenden Phase-II-Enzymen des Fremdstoffmetabolismus[1] und induzieren darüber hinaus in Tumorzellen Zellzyklusarrest und Apoptose[2]. Über die biologische Wirkung von Nitrilen ist jedoch nur sehr wenig bekannt, obwohl sie das Hauptprodukt beim thermisch-induzierten Abbau (z.B. beim Kochen von Brassica-Gemüse) der Glucosinolate darstellen[3]. In diesem Zusammenhang stellt die Ermittlung der zytotoxischen Wirkung dieser Stoffe auf humane Zellen einen ersten wichtigen Ansatz zur systematischen Erforschung ihrer biologischen Relevanz dar.

    Anhand des in-vitro Modells der Lebertumor-Zelllinie HepG2 wurde der Einfluss von verschiedenen Nitrilen auf die Zellviabilität in Abhängigkeit von der chemischen Struktur ermittelt. Als Marker für die Viabilität wurde die mitochondriale Dehydrogenaseaktivität (WST-1 Assay) eingesetzt. Betrachtet wurden aliphatische und aromatische Nitrile, sowie Thioalkylnitrile. Für die Untersuchungen wurde ein Konzentrationsbereich von 0,3-30 mmol/L in logarithmischen Verdünnungen gewählt.

    Eine Abnahme der Zellviabilität zeigte sich bei den aromatischen Nitrilen und den Thioalkylnitrilen erst ab einer Konzentration von 30 mmol/L. Am sensitivsten reagierten die Zellen hierbei auf die Thioalkylnitrile. Mit zunehmender Kettenlänge dieser schwefelhaltigen Nitrile sank die Zellviabilität der HepG2-Zellen um bis zu 70% (7-Methylthioheptylnitril). Die korrespondierenden aliphatischen Nitrile (ohne zusätzlichen Schwefel in der Kohlenstoffkette) wiesen keine signifikante Wirkung auf die Zellviabilität im untersuchten Konzentrationsbereich auf. Die vorliegenden Daten lassen darauf schließen, dass unter physiologischen Bedingungen die Zytotoxizität der Nitrile keine biologische Relevanz hat.

    [1] Matusheski NV, Jeffery EH (2001), J Agr Food Chem, 49(12), 5743-5749.
    [2] Lamy E, Mersch-Sundermann V (2009), Environ Mol Mutagen, 50(3), 190-200.
    [3] Hanschen et al. (2012), J Agr Food Chem, 60, 2231-2241.

  16. Isolation and characterization of bioactive compounds from Scenedesmus sp. BySpiral Coil Countercurrent Chromatography (spiral-CCC)

    M. Schafberg, G.  Jerz, E. Kurth, K. Loest, P. Winterhalter, S. Rohn, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    This BMELV/ BLE funded project ‘FENA – Fish meal and oil alternatives for a durable, sustainable aquaculture’ has the aim to develop a high quality fish feed based on yeast and algae to reduce the demand for fish meal and oil, which are currently the main components of many fish feed [1].
    To date there is little evidence of the metabolic profile of Scenedesmus sp.  Chlorophyceae, Chlorococcales, Scenedesmaceae), a micro green algae [2,3]. Antioxidant components have been described in Scenedesmus species and detected by HPLC-onlineTEAC, but not yet sufficiently characterized. The focus is the characterization of compounds, that are responsible for the high antioxidant activity [Fig. 1].
    Freeze-dried cells of Scenedesmus sp. were exhaustively macerated in MeOH. The metabolites of the extract was partitioned by LLE with solvents of different polarities (n- hexane, CH2Cl2, EtOAc), and then fractionated in a 5.5 liter preparative spiral-CCC unit (5 g of CH2Cl2 extract) [4,5]. The two-phase system n-hexane/ACN [1:1 (v/v)] was operated in the ‘head - to-tail’ mode. By using elution and extrusion the spiral-CCC separation was obtained in 28 fractions. The further chromatographic separations were performed using CC, SPE and/or preparative HPLC. To check the purity of the fractions, the samples were diluted by a factor of 2 and analyzed by offline continuous injection APCI-MS/MS in positive and negative ionization mode. This APCI-MS/MS profiling of preparative spiral-CCC fractions enabled a targeted and precise fractionation of the metabolites. By profiling (fig 1) can be shown, that there is a clear separation of carotenoid (2) and chlorophyll (3,4) derivatives and their degradation products (1,3,5) [6]. A final structure elucidation of isolated compounds was performed by 1D/2D-NMR-spectroscopy and biological- chemical evaluation.

    [1] Joint project: FENA - Fischmehl- und -öl Ersatzstoffe für eine nachhaltige Aquakultur - subproject 5, http://www.fisaonline.de/
    [2] M.D. Guiry in Guiry, M.D. & Guiry, G.M. (2013) AlgaeBase. World-wide electronic
    publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org
    [3] The National Center for Biotechnology Information, www.straininfo.net/taxa/373792/browser/ncbi_approx
    [4] Köhler et al. (2004), J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 27:16, 2547 [5] Ito (2005), J. Chromatogr. A 1065 (2), 2005, 145.
    [6] Jerz et al., Recent Advances in the Analysis of Food and Flavors, pp 145-165. ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, 2012.

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  17. Antioxidative phenolische Inhaltsstoffe in C. incanus Tee – Abhängig vom Blatt-zu-Holz-Verhältnis und der Partikelgröße des Teekrautes?

    P. Riehle, N. Rusche, S. Rohn, HSFS Hamburg

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    Abstract

    Cistus incanus zählt zu den Zistrosen, einer verbreiteten Pflanzenfamilie im Mittelmeergebiet [1]. Aktuell bieten zahlreiche Hersteller trotz der offiziellen Bewertung als Novel Food durch die Europäische Kommission, Tee oder Nahrungsergänzungsmittel auf der Basis von C. incanus an. Diese Produkte werden bezüglich eines hohen Gehaltes sowie einer Vielfalt an phenolischen Substanzen in Verbindung mit hohen antioxidativen Kapazitäten und zahlreichen gesundheitsfördernden Effekten beworben. Dabei können die Konzentrationen der phenolischen Inhaltsstoffe stark von der Beschaffenheit des verarbeiteten Pflanzenmaterials abhängen. Insbesondere das Blatt-zu-Holz-Verhältnis sowie die Partikelgröße des Teekrautes können hier einen entscheidenden Einfluss haben.

    C. incanus Tee enthält eine Vielzahl phenolischer Verbindungen, darunter Phenolsäuren, Flavanole, Flavonolglycoside und Ellagitannine [2]. Dabei korrelieren die Gehalte einiger dieser antioxidativen Inhaltsstoffe, wie z.B. Gallussäure, Myricitrin, Quercitrin, HHDP-Glucose oder Ellagsäure stark positiv mit dem Blattanteil, bzw. negativ mit dem Holzanteil des Teekrautes. Die Konzentrationen können sich dabei um mehrere hundert Prozent unterscheiden. Für Catechin hingegen konnten weitgehend ähnliche Konzentrationen im Holz- und Blattanteil ermittelt werden. Weiterhin wurde eine effektivere Extraktion phenolischer Substanzen aus dem Teekraut mit abnehmender Partikelgröße bei fast allen der genannten Verbindungen beobachtet. Auch hier wurden hohe Konzentrationsunterschiede der phenolischen Inhaltsstoffe von mehr als hundert Prozent ermittelt. Die Gehalte von z.B. Gallussäure, Tilirosid und Ellagsäure hingegen korrelierten kaum mit der Partikelgröße, was auf eine gute Zugänglichkeit im Pflanzenmaterial und eine damit verbundene hohe Extraktionsausbeute hindeutet.
    Insgesamt resultiert aus den Ergebnissen dieser Arbeit, dass für hohe Gehalte antioxidativer phenolischer Inhaltsstoffe in C. incanus Tee ein hoher Blattanteil, bzw. ein geringer Holzanteil sowie eine kleine Partikelgröße des Teekrautes von Vorteil sind. Für den Verbraucher wäre so beispielsweise durch Blattfeinschnitt, angeboten in Form von Teebeuteln, ein hoher gesundheitlicher Nutzen durch den Konsum des Tees denkbar. Trotzdem kann unabhängig von den vorliegenden Ergebnissen ein gewisser Holzanteil entscheidend für die sensorischen Eigenschaften des Tees sein. Daher stellt die Beurteilung des Blatt-zu-Holz-Verhältnisses sowie der Partikelgröße einen wichtigen Aspekt in der Beurteilung der Qualität von C. incanus Tees dar.

    [1] E. Barrajón-Catalán et al., Phytochem Anal. 2011, 22: 303-312
    [2] P. Riehle et al., Food Res. Int. 2013, 53 (2): 891-899

  18. Metabolic Profiling: Eine neue LC-ESI-MRM-Multimethode zur quantitativen Bestimmung von 39 Sterolen in diversen biologischen Matrices

    P. Werner, M. Fischer, K. Wegner, S. Rohn, C. Weigelt, A. Worthmann, L. Scheja, J. Heeren, HSFS Hamburg

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    Abstract

    Sterole gehören zur Gruppe tetracyclischer organischer Verbindungen, welche an Position 3 des Steran-Grundgerüstes über eine 3α-Hydroxy-Gruppe verfügen. Diese auch als 3-Hydroxysteroide bezeichneten Stoffe, gehören zur Gruppe der Steroide und finden sich als Naturstoffe in nahezu allen lebenden Organismen unter anderem in Form von Gallensäuren, Steroidhormonen und Calciferolen.

    Das am häufigsten vorkommende Sterol im tierischen Organismus ist das Cholesterin. Cholesterin ist ein essentieller Bestandteil von Zellmembranen und stellt unter anderem die Vorstufe für die Biosynthese von Steroidhormonen und Gallensäuren dar.

    Auf Grund der Beteiligung dieser Stoffe an verschiedensten Stellen des Fettstoffwechsels können die Veränderungen der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung der Steroide in verschiedenen Organen des Körpers zur Erforschung der Veränderungen des Fettstoffwechsels im Hinblick auf ernährungsphysiologische und pathologische Zustände herangezogen werden. Besonders der Vergleich von Metabolit-Stoffkonzentrationen aus verschiedenen Matrices wie Blut, Urin, Galle, Leber und Fettgewebe ist von herausragender Bedeutung zur Entwicklung neuer Hypothesen über das Verständnis von Veränderungen des Stoffwechsels des humanen Organismus während der Ätiologie von Krankheiten und ernährungsphysiologischer Veränderungen.

    Auf Grund der hohen strukturellen Ähnlichkeit der zu untersuchenden Metabolite bei gleichzeitig hohen Anforderungen an die Selektivität der Analytik hat sich die flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie als weitestgehend konkurrenzlos gegenüber anderen analytischen Vorgehensweisen herausgestellt. Die entwickelte Methode nutzt auf Basis eines sensitiven Triple-Quadrupol Massenspektrometers das Multiple Reaction Monitoring (MRM) zur deutlichen Erhöhung der Selektivität der Analytik. Allerdings konnten besonders bei Stellungsisomeren von Analyten teilweise keine eindeutigen Übergänge identifiziert werden, sodass in diesen Fällen die Retentionszeit als Selektivmerkmal herangezogen werden muss. Der unpolare Grundcharakter der Steroide bei gleichzeitiger Unterscheidung untereinander durch Stellung funktioneller Gruppen primär polaren Charakters stellt in Bezug auf die chromatographische Trennung eine besondere Herausforderung dar. Eine ausreichende Retardation auf Basis des unpolaren Grundcharakters der Analyten und eine gleichzeitig hohe chromatographische Auflösung auf Basis einer polaren Selektivität konnte durch die Verwendung einer „polar-embedded“-RP-Säule erreicht werden. Die hier entwickelte Methode ist dazu geeignet 39 für den Lipidwechsel relevante Steroide in Blut, Urin, Galle, Leber und Fettgewebe-proben in einem Zeitraum von 35 Min selektiv und quantitativ zu bestimmen.

  19. Food Profiling: Authentizitätsbestimmung von Lebensmitteln

    J. Klare, M. Creydt, C. Felbinger, P. Werner,  T. Hackl, M. Fischer, HSFS Hamburg

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    Abstract

    Die Authentizität von Lebensmitteln ist ein zunehmend entscheidendes Merkmal für Lebensmittel in allen Bereichen der globalen Beschaffungskette. Immer mehr werden dabei von Verbraucherseite die Herkunft eines Lebensmittels und dessen Anbaubedingungen als kaufentscheidende Qualitätsmerkmale  angesehen, für die zum jetzigen Zeitpunkt allerdings keine ausreichenden analytischen Nachweisstrategien existieren.

    Grundkonzept eines Metabolomics-basierten Ansatzes zur Authentizitätsbestimmung von Lebensmitteln ist die Annahme, dass die Metabolome von Lebensmitteln mit unterschiedlichen Authentizitätsparametern sich in Konzentration oder Anwesenheit verschiedener Metabolite unterscheiden. Zum Auffinden dieser Unterschiede ist es notwendig analytische Systeme zu verwenden, die es ermöglichen in möglichst kurzer Analysezeit möglichst viele Analyten innerhalb eines Lösungsmittelextraktes unter Akquisition verschiedener qualitativer und quantitativer Parameter zu messen.

    Eine solche Nachweisstrategie wird beispielhaft im Hinblick auf die Differenzierung verschiedener Anbaugebiete und Anbaubedingungen für Tomaten und Tomatenprodukte auf Basis der Kombination eines UHPLC-UHR-qToF-MS-Systems (MaXis) und eines NMR-Systems (AvanceIII, 600MHz) entwickelt. Die in diesem Rahmen entwickelten Standardprotokolle sollen auf eine Vielzahl verschiedener Lebensmittel anwendbar sein.
    Um einen umfassenden Überblick über das Lebensmittel zu erhalten, werden neben dem Metabolomics-basierten Ansatz molekularbiologische Methoden im Bereich Genomics zur Sortendifferenzierung angewandt. So können sowohl beabsichtigte als auch ungewollte Vermischungen des Lebensmittels mit solchen minderwertigerer Qualität nachgewiesen werden.

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  20. Selektion und Charakterisierung von Aptameren mit einer Affinität gegenüber Alicyclobacillus-Sporen für eine Bioaffinitätsanreicherung

    T. Hünniger, C. Fischer, L. Herrmann, M. Fischer, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    Die sporenbildenden thermoacidophilen Alicyclobazillen, wie bspw. Aliclobacillus acidoterrestris, A. acidiphilus und A. herbarius, bilden nach Auskeimung der Sporen in verschiedenen Lebensmitteln (z.B. Orangensäften) im Zuge des Stoffwechsels ein rauchig bzw. nach Desinfektionsmitteln riechendes off-Flavour (Guajacol, 2,6-Dibromophenol sowie 2,6-Dichlorophenol). Derzeit stehen der Fruchtsaftindustrie nur bedingt analytische Methoden zur Verfügung, die während des Routinebetriebes einen zeitnahen Nachweis von Alicyclobacillus-Sporen ermöglichen. Da stets eine zeitaufwendige Anreicherung durch mikrobiologische Kultivierung auf Agarplatten notwendig ist, wird für ein entsprechendes Analysenergebnis zumeist etwa 3 bis 7 Tagen benötigt. Dies führt letztendlich zu längeren Lagerzeiten und höheren -kosten für die Fruchtsaftindustrie.

    Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung eines Aptamer-basierten Bioaffinitäts-Anreicherungssystems über modifizierte Nanopartikel für die Lebensmittelmatrix Orangensaft, wobei die anschließende qualitative und quantitative Bestimmung der Sporen mittels molekularbiologischer Methoden erfolgt. Die verwendeten Sporen-spezifischen Aptamere (einzelsträngige DNA) dienen dabei als Rezeptormoleküle und ersetzen die zeitintensive mikrobiologische Anreicherung der Alicyclobacillus-Sporen.

    Die Sporen-spezifischen ssDNA-Aptamere wurden nach einem speziellen in vitro Selektionsverfahren (SELEX-Prozess: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) generiert. Hierfür wurden unterschiedliche Schritte des SELEX-Verfahrens, wie bspw. die Einführung der emPCR zur Amplifikation von DNA-Templaten mit hoher Diversität, optimiert. Des Weiteren wurden unterschiedliche Methoden, wie die Anwendung eines Diversitätsassays und radioaktive Bindungsstudien, als Selektionskontrolle durchgeführt. Nach erfolgreicher Klonierung und Sequenzierung wurden im Anschluss 12 Aptamere erhalten, die einer umfangreichen Charakterisierung hinsichtlich der Affinität, Selektivität und Spezifität gegenüber den Alicyclobacillus-Sporen unterzogen wurden. Für die Charakterisierung der Aptamere wurden diverse Methoden durchgeführt: Die Bestimmung der Affinitäten mittels SPR (Surface Plasmon Resonance) und Durchflusszytometrie, die Identifizierung von G-Quadruplex-Strukturen mittels CD-Spektroskopie und die Visualisierung der Aptamer-Sporen-Interaktionen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

    Nach erfolgreicher Kopplung der Aptamere an magnetische Nanopartikel erfolgt die Validierung des Anreicherungssystems, welches letztendlich die zeitaufwendige mikrobiologische Kultivierung ersetzen soll. Als qualitative und quantitative Nachweismethoden werden anschließend unterschiedliche molekularbiologische Methoden, wie die (real time-)PCR, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) oder Apta-PCR, Anwendung finden.
    Bei einer möglichen Kontamination von Lebensmitteln wäre somit innerhalb kurzer Zeit eine sichere Analytik mit dieser molekularbiologischen Methode möglich.

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  21. just in time-Selection: Entwicklung eines halbautomatisierten SELEX-Verfahrens für die zeitnahe Generierung von Aptameren

    T. Hünniger, H. Wessels, C. Fischer, L. Herrmann, M. Fischer, HSFS Hamburg

    Details

    Abstract

    Durch die Richtlinie 2010/63/EU und der darin formulierten Forderung den Einsatz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken nach Möglichkeit zu meiden, wird die Entwicklung von Methoden, welche die Antikörper-basierten Nachweise (z.B. ELISA) ersetzen, gefordert. Durch ihre Eigenschaften der hohen Affinität und Spezifität stellen Aptamere ein potenzielles in vivo-Analoga dar.

    Die Selektion von Aptameren erfolgt durch einen speziellen in vitro Selektionsprozess, welcher als SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) bezeichnet wird. Ausgehend von einer Aptamerbibliothek, die einen Pool an Aptameren mit randomisierter Sequenz darstellt und eine Diversität von ca. 1015 unterschiedlichen Aptameren aufweist, wird diese mit einem Target inkubiert. Dies stellt den eigentlichen Selektionsschritt der Aptamere dar, wobei jene mit einer Affinität gegenüber dem Target von nicht-bindenden Aptameren getrennt werden. Die weniger bzw. nicht-bindenden Aptamere werden durch entsprechende Waschschritte entfernt, sodass die Aptamere mit einer Affinität gegenüber dem Target eluiert werden können. Diese werden im Anschluss mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt, wodurch doppelsträngige PCR-Produkte entstehen, die wiederum einer Strangtrennung unterzogen werden müssen. Aus der Strangtrennung resultieren letztendlich die vervielfältigten Aptamere mit einer Affinität gegenüber dem Target, die wiederum einer neuen Selektionsrunde unterzogen werden können. Nach etwa 10 - 17 dieser SELEX-Runden erfolgt die Klonierung und Sequenzierung der entsprechenden Selektionsrunde, aus der die Aptamersequenzen erhalten werden. Die Aptamere weisen in der Regel Bindungsparameter (z.B. KD-Wert) auf, die mit denen von Antikörpern vergleichbar sind.

    Der sehr umfangreiche und zeitaufwendige SELEX-Prozess kann bis zu mehreren Monaten dauern und wurde daher durch die Verwendung eines magnetischen Separators und die Anwendung des s. g. BEAMings (Beads, Emulsion, Amplification, Magnetic) dahingehend optimiert, dass einerseits eine halbautomatisierte Durchführung im Mitteldurchsatz (12 SELEX-Prozesse parallel) möglich ist und andererseits eine starke Vereinfachung der Durchführung vorgenommen wurde. Die just in time-Selection erfolgt in zwei Teilschritten, dem Fishing (automatisierter Prozess bestehend aus Inkubation, Waschen und Elution) und dem BEAMing (bestehend aus Amplifikation und Strangtrennung). Dies hat diverse Vorteile, wie die starke Verringerung des Kontaminationspotenzials des Prozess durch die Halbautomatisierung oder die Erhöhung der Reproduzierbarkeit des in vitro-Verfahrens.

    Das Resultat der umfangreichen Methodenentwicklung und -optimierung ist, dass die just in time-Selection in der Regel in etwa zwei Wochen im Mitteldurchsatz (12 SELEX-Prozesse zeitgleich) vollständig durchgeführt werden kann. Dies hat zur Folge, dass Aptamere für entsprechende Fragestellungen zeitnah zur Verfügung gestellt werden können.

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  22. Die Terpenbiosynthese als Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Antiinfektiva

    A. Schäding, A. Hoppe, T. Gräwert, B. Illarionov, M. Fischer, HSFS Hamburg

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    Abstract

    Die Terpenbiosynthese stellt einen essentiellen Stoffwechselweg dar, jedoch sind nicht alle Organismen mit der gleichen Enzymausstattung versehen. Die Vorstufen der Terpene Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP) und Dimethylallyl-Pyrophosphat (DMAPP) können vielmehr über zwei unterschiedliche Wege synthetisiert werden – den Mevalonat-Weg und den Non-Mevalonat-Weg. Während Pflanzen und wenige Mikroorganismen, wie z. B. das lebensmittelpathogene Bakterium Listeria monocytogenes, der Erreger der Listeriose, die genetischen Anlagen für beide Wege haben, beschränkt sich die enzymatische Ausstattung bei den meisten Organismen auf einen Weg. Säugetiere und die meisten grampositiven Mikroorganismen beschreiten ausschließlich den Mevalonat-Weg, während viele gramnegative Mikroorganismen, wie die lebensmittelübertragenden Keime Salmonella typhimurium und Campylobacter jejuni, sowie Protozoen, wie Plasmodium falciparum, der Erreger der humanen Malaria, IPP und DMAPP nur über den Non-Mevalonat-Weg synthetisieren können. Durch die Inhibition eines Enzyms dieses Biosyntheseweges, wie zum Beispiel IspD (4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Synthase) und IspE (4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase) können keine Terpene synthetisiert werden. Da diese u.a. Vorstufen für einige Vitamine und Hormone sind, kommt es zu einer Hemmung des Wachstums der Mikroorganismen.
    Um neue Antiinfektiva entwickeln zu können müssen die entsprechenden Zielproteine, die gehemmt werden sollen, zunächst dargestellt werden. Hierfür wurde ein an den Expressionsstamm Escherichia coli angepasstes Gen (codon usage, GC-Gehalt) rekombinant exprimiert und anschließend über chromatographische Verfahren angereichert. Die spezifische Aktivität der gereinigten Proteine wurde dann über einen Hilfsenzym-gekoppelten photometrischen Assay bestimmt. Nach Übertragung des Assays in ein robotertaugliches 384-Well-Format und weiterer Optimierungen konnten im High-Throughput Screenings (HTS) bereits nach geeigneten Inhibitoren gesucht werden. Es wurden mehrere tausend Verbindungen auf ihre Hemmwirkung gegen die Zielproteine getestet. Verbindungen, die eine hohe Aktivität gegen das Zielenzym zeigen, werden nachfolgend in einem in vivo-Assay direkt auf ihre Wirksamkeit getestet. Dazu werden Counterscreens gegen die Hilfsenzyme im Aktivitätsassay sowie IC50-Bestimmungen durchgeführt.

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  23. Thermische Stabilität von Curcumin unter Modellbedingungen

    K. Ulbrich,  J. Haeger, S. Rohn, HSFS Hamburg

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    Abstract

    Curcumin gehört zu den sekundären Pflanzenstoffen und wird aus Gelbwurz (Curcuma longa) gewonnen. Dabei handelt es sich chemisch gesehen um zwei Ferulasäure-Einheiten, die durch eine Methylengruppe miteinander verknüpft sind. Es stellt einen wesentlichen, farbgebenden Bestandteil von Currypulver dar und wird als Lebensmittelzusatzstoff verwendet. Aktuelle Studien beschäftigen sich vor allem mit der Bioaktivität von Curcumin wie dessen antioxidative, entzündungshemmende, antikanzerogene sowie protektive neurodegenerative Eigenschaften [1,2,3]. Dass Curcumin jedoch in seiner Verwendung als Lebensmittelzutat oder -zusatzstoff einer weiten Prozessierung und damit auch chemischen Veränderungen unterliegen kann, wurde dabei bisher kaum berücksichtigt. Bei Untersuchungen zur Stabilität in wässrigen Medien bei 37°C und verschiedenen pH-Werten wurden Bicyclopentadion, Vanillin, Ferulasäure sowie Feruloylmethane identifiziert [4]. Es ist bereits bekannt, dass die Ferulasäure einem thermischen Abbau u.a. zu 4-Vinylguajacol und (2E)-3-(4-Hydroxy-2-[1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethyl]-5-methoxyphenyl)-propensäure unterliegt. Aufgrund struktureller Gemeinsamkeiten von Ferulasäure und Curcumin entstehen bei einer thermischen Behandlung von Curcumin ähnliche Abbauprodukte.

    Um dies zu zeigen, wurde Curcumin bei verschiedenen Temperaturen (100°C, 130°C) gekocht und bei 180°C geröstet. Die Dauer der thermischen Behandlung wurde variabel gehalten. Die volatilen Abbauprodukte wurden mittels HS-SPME-GCMS analysiert und mit Hilfe von Datenbanken identifiziert. Mittels HPLC-DAD und LC-MS wurden anschließend die nicht-flüchtigen Verbindungen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch das Kochen von Curcumin eine Reihe aromarelevanter Verbindungen, wie Vanillin, Phellandren, p-Cymen, Acetovanillon und sogar Eucalyptol entstehen. In geringen Mengen wurde auch Ferulasäure detektiert. Beim Rösten von Curcumin wurden, neben den bereits durch das Kochen entstandene, weitaus mehr aromarelavante Verbindungen in größerer Menge detektiert. Dazu zählen z.B. das ar-Turmeron, 4-Vinylguaiacol, Guaiacol oder das ar-Curcumen.

    [1] Aggarwal BB. Int J Biochem Cell Biol 2009, 41, 40-59.
    [2] Villaflores OB. Taiwan J Obstet Gynecol 2012, 51, 515-525.
    [3] Rimbach G. Angew. Chem. 2012, 124, 5402-5427.
    [4] Gordon ON. Trends in Mol Med 2012, 18 (7), 361-363.

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  24. Isolation of Phospholipids, Glycolipids and Fatty Acids from Baby Banana Peels (Musa acuminata) on a Preparative Scale by Means of High-Speed Countercurrent Chromatography

    M. Castro-Benitez, M. Timpe, P. Winterhalter, TU Braunschweig

    Details

    Abstract

    Phospho- and Glycolipids, together with proteins, are the building blocks of biological membranes. Hence, they invariably occur in all foods of animal and plant origin. As surface-active compounds, phospho- and glycolipids contain hydrophobic moieties (acyl residue, N-acyl sphingosine) and hydrophilic portions (phosphoric acid, carbohydrate). Therefore, they are capable of forming arranged structures and serve as valuable ingredients because of their nutritional value and their technological properties (e.g., as emulsifier).[1]

    The lipid composition of unripe banana peel resembled other photosynthetic tissues in possessing a high proportion of mono- and di-galactosyl diacylglycerols, containing predominantly polyunsaturated fatty acids, particularly linolenic and linoleic acid.
    A preparative isolation protocol was established to isolate phosphatidylcholine , O-α-D-Galp-(1´´→6´)-O-β-D-Glup-(1´→2)-1,3-diacyl-D-glycerol and linoleic acid from the peel of baby bananas from Colombia. High speed countercurrent chromatography (HSCCC) fractionated the complex metabolite profile and the compounds were identified in a fraction recovered by off-line preparative C18 HPLC [2]. Structure elucidation was done by modern spectroscopic techniques including LC-APCI-MS/MS and 1D/2D-NMR experiments (13C, 1H/1H-COSY, HSQC, 31 P and HMBC).

    HSCCC as all-liquid preparative chromatography technique completely omitted irreversible chemi-adsorption effects. The elution mode used in the separation was ‘head-to-tail’ and the solvent system was hexane/CH2Cl2/EtOH/H2O (2:1:3:1, v/v/v/v) and 405.56 mg from the dried extract of banana peel was injected. The flow rate of the mobile ethanol/water phase was set to 3.5 mL/min and for detection λ 440 nm was used. A target fraction from elution phase contained 62.25 mg of lipids (TLC-results). Reversed-phase C18 semi preparative HPLC was carried out on a  Phenomenex Luna 5 μ column (250 x 15 mm) using MeOH/EtOH (70:30, v/v) as isocratic eluent. 

    1)    Kaffarnik S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61, 7061-7069.
    2)    Ito Y., Journal of Chromatography A, 2005, 1065, 145-168.

    Marcela Castro-Benitez is grateful for the DAAD scholarship No A/06/3294.