Differenzierung der Kakaosorten CCN51 und Arriba anhand von Sequenzunterschieden in ihrer Plastiden-DNA

FSMI 2013

Vortrag von L. Herrmann, 19.02.2013

Luise Herrmann, Ilka Haase, Markus Fischer
HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE - www.hsfs.org

Arriba zählt zu den wichtigsten Edelkakaosorten und zeichnet sich durch sein einmaliges Aroma aus. Er wird in Ecuador angebaut, dem weltweit stärksten Edelkakaoexportland (50 % des Welthandels); insgesamt macht der Edelkakaoanteil jedoch nur 5 % der gesamten Kakaoernte aus. Ebenfalls in Ecuador angebaut wird die Konsumkakaosorte CCN51, die den wesentlich größeren Anteil der Ernte ausmacht. Diese Sorte ist aromaschwächer, hat allerdings den Vorteil, robuster und ertragsreicher zu sein. Beide Sorten werden im selben Land kultiviert und es besteht das Risiko einer beabsichtigten aber auch versehentlichen Vermischung. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse von Seiten der Kakaoindustrie an einer analytischen Methode für die Differenzierung der Sorte Arriba von der Sorte CCN51 sowie dem Nachweis einer Vermischung.
Da sich beide Kakaosorten, wie bereits eben erwähnt, in verschiedenen Eigenschaften, wie beispielsweise dem Ertrag, der Resistenz gegenüber Krankheiten und im Aromaprofil unterscheiden, ist davon auszugehen, dass sich diese Unterschiede durch eine individuelle genetische Ausstattung ausgeprägt haben. DNA hat den Vorteil, dass sie individuell für jeden Organismus ist und ihre Sequenz nicht durch äußere Begebenheiten (Klima, Stress etc.) beeinflusst wird.. Die DNA tritt in Form verschiedener Typen auf: So verfügt jede Pflanze z. B. sowohl über eine Kern- als auch eine Chloroplasten-DNA. Eine Abweichung in der Sequenz der DNA von Arriba und CCN51 im Chloroplasten-Genom zu finden, ist wahrscheinlicher als in der nukleären DNA: Die Plastiden-DNA verfügt generell über eine höhere genetische Variabilität als die Kern-DNA. Ein Vorteil ist zusätzlich, dass CCN51 als Klon fast ausschließlich vegetativ vermehrt wird, d.h. es kommt zu keiner genetischen Vermischungen durch Bestäubung. Bei einer eventuell doch auftretenden Fremdbestäubung würde zwar die nukleäre DNA rekombinant vererbt werden, das Plastidengenom würde jedoch CCN51-typisch bleiben, da es rein maternal vererbt wird. Es ist deshalb davon auszugehen, dass sämtliche CCN51-Klone einen identischen Genotyp aufweisen.
Im Rahmen des Projektes wurden komplette Plastidengenome (ca. 160 kbp) sequenziert. Auf der Grundlage von Sequenzunterschieden zwischen den Plastidengenomen der beiden untersuchten Kakaosorten können anschließend PCR-basierte analytische Methoden entwickelt werden. Beispielsweise können bei einer unterschiedlichen Anzahl an Wiederholungen eines sogenannten SSR (Simple Sequence Repeats) mittels PCR verschieden lange PCR-Produkte aus der DNA der beiden Kakaosorten amplifiziert und über eine Agarosegelelektrophorese, über Kapillargelelektrophorese oder DHPLC (Denaturierende HPLC) detektiert werden. Alternativ können geringere Unterschiede - wie z. B. ein Einzelbasenaustausch - genutzt werden, um eine LPA (Ligation Probe Amplification) oder eine PCR-RFLP mit spezifischen Restriktionsenzymen (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism) durchzuführen. Auch eine unterschiedliche Schmelztemperatur ergibt sich aus verschieden langen oder sequenziell unterschiedlichen PCR-Produkten. Mit den genannten Methoden ist es somit möglich, zwei genetisch sehr ähnliche Genotypen wie Arriba und CCN51 eindeutig voneinander zu unterscheiden.